Dermatologia Praktyczna

W początkowych latach stosowania kriochirurgii sądzono, że główna przyczyna śmierci komórki wynika z mechanicznych uszkodzeń przez kryształy lodu (Pusey, 1907 r.). W warunkach in vitro wykazano, że kryształy lodu formowane najpierw w środowisku zewnątrzkomórkowym mogą stopniowo ścieśniać komórki razem. Nie wykazano bezpośrednio, by w ten sposób dochodziło do rozerwania błony komórkowej. Jednak pomiary zmian objętości w przedziale zewnątrz- i wewnątrzkomórkowym podczas zamrażania i rozmrażania potwierdziły taką możliwość. Przemianie wody w lód towarzyszy powstanie energii cieplnej, która jako utajone ciepło zamrażania osiąga wartość 80 kalorii na gram wody.

Podczas powolnego ochładzania tkanki, w przedziale temperatury -5°C – -15°C, dochodzi do powstania dużych kryształów lodu w środowisku zewnątrzkomórkowym. Z badań Trumpa i wsp. wynika, że wyłącznie zewnątrzkomórkowo ułożone kryształy lodu nie są wystarczające do śmierci komórki. Krystalizacja wody prowadzi do wzrostu stężenia elektrolitów w pozostałej objętości. Zmiana gradientów stężeń pomiędzy komórką a płynem zewnątrzkomórkowym jest przyczyną postępującego odwodnienia wnętrza komórki i zmiany jej objętości. Wynikający z niego wzrost stężenia elektrolitów powoduje obniżenie temperatury zamarzania. Jest to zjawisko przechłodzenia komórki. Granica przechłodzenia występuje w temperaturze około -22°C, kiedy obserwuje się krystalizację wody w komórce. W tkance nowotworowej proces ten kończy się dopiero w temperaturze -35°C, co tłumaczy się zwiększeniem zawartości wody związanej. Według Litvana zmiany stężeń elektrolitów i odwodnienie mogą powodować przerwanie ciągłości błon komórkowych. Z badań erytrocytów in vitro wynika, że uszkodzenia komórki pojawiają się nawet przy braku środowiska hipertonicznego, co Farrant wiąże z rozerwaniem fosfolipidów błon komórkowych. Środowisko hipertoniczne wnętrza prowadzi do przechodzenia jej składowych (np. hemoglobiny w erytrocytach) poza błonę komórkową i wynikających z tego nieodwracalnych uszkodzeń. Szybkie przemieszczanie się elektrolitów może być również przyczyną zmian białek i enzymów. Zahamowaniu ulega synteza DNA.

Przy dużej prędkości zamrażania, około 60-100°C/min, następuje jednoczesne formowanie się lodu wewnątrz- i zewnątrzkomórkowo, co przeciwdziała wymianie roztworów i powstaniu przechłodzenia wody. Liczba kryształów lodu rośnie wraz ze wzrostem tempa schładzania, natomiast odwrotna zależność dotyczy ich wielkości.

Według Trumpa obecność kryształów lodu we wnętrzu komórki jest przyczyną uszkodzeń mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego. Mc Gann i wsp. uznają rozpad lizosomów za najważniejszą przyczynę uszkodzeń komórek zamrażanych, w warunkach których pojawia się ich dehydratacja. Natomiast w czasie szybkiego zamrażania z tworzeniem lodu wewnątrzkomórkowo pierwotne zaburzenia dotyczą błon plazmatycznych.

Badania Szmurły wykazały, że prędkość zamrażania przekraczająca 60°C/min zmniejsza przewodnictwo cieplne tkanki wskutek pojawienia się mikropęknięć przestrzeni międzykomórkowych. Zjawiska te wynikające z rozkładu naprężeń w tkance tworzą obszary o własnościach fizycznych próżni, w których przenoszenie energii jest zmniejszone, ograniczając tym samym strefę destrukcji. Nasilenie uszkodzeń wewnątrzkomórkowych zwiększa się przy wzroście kryształów. Proces rekrystalizacji, to jest agregacji małych kryształów lodu w większe bryły, jest szczególnie nasilony podczas powolnego rozmrażania tkanki. Sugeruje się, że faza rozmrażania działa na tkanki równie destrukcyjnie, jak początkowe zamrażanie, a zakres uszkodzeń zwiększa się przy jej spowolnieniu. Przyspieszenie okresu rozmrażania zwiększało przeżycie komórek, nawet zamrożonych wewnątrzkomórkowo. Gage i wsp. zalecają podczas tej fazy utrzymywanie oziębionego aplikatora na miejscu mrożenia. Szybkość rozmrażania tkanki nie powinna przekraczać 10°C/min.

Innym czynnikiem wynikającym z techniki zamrażania, a wpływającym na zakres martwicy, jest wydłużenie okresu maksymalnego obniżenia temperatury w tkance, a także powtórzenie cyklu szybkiego zamrożenia i wolnego rozmrażania. Powtarzanie cyklu mrożenie–rozmrożenie powiększa objętość tkanki zamrożonej m.in. wskutek zwiększenia jej przewodności cieplnej.

Mechanizm uszkodzenia tkanek wynika nie tylko z bezpośredniego działania niskich temperatur na komórkę, ale także z rozwijającej się po rozmrożeniu stazy naczyniowej. Badania doświadczalne wykazały, że obniżenie temperatury od +11 do +3°C zmniejsza o 2/3 krążenie włośniczkowe, podczas gdy w tętniczkach i żyłkach tylko o 35-40%. Rothenborg obserwował zupełne ustanie przepływu krwi tak długo, jak utrzymywała się temperatura poniżej 0°C, niezależnie od długości mrożenia i osiągniętej minimalnej temperatury.

W trakcie zabiegu skurcz naczyń powoduje zahamowanie przepływu i zastój krwi w obszarze zamrożenia. Zatrzymanie krążenia jest natychmiastowe i całkowite w większości włośniczek. W średnich i większych naczyniach o przekroju > 0,33 mm do ustania krążenia dochodzi po kilku dniach. W naczyniach o jeszcze większym przekroju kriochirurgia nie powoduje skurczu i zachowują one swoją funkcję. Powrotowi krążenia, w około 30 min po zamrożeniu, towarzyszy szybki wzrost temperatury, rozszerzenie kapilarów i drobnych naczyń żylnych z obecnością blokujących światło zagęszczeń krwinek. Pojawiające się niekiedy w tym okresie krwawienie tłumaczy się otwarciem połączeń tętniczo-żylnych w uszkodzonym obszarze. Już w pierwszej godzinie po rozmrożeniu pojawiają się zmiany w ultrastrukturze ścian naczyń, które prowadzą do masywnego wysięku. Kulka w swoich badaniach sugeruje, że wyrównawczo wobec zatorów w mikrokrążeniu obwodowym w głębszej sieci naczyń skóry pojawia się przeciek tętniczo-żylny.

W tkance bezpośrednio otaczającej strefę mrożenia wykazano techniką dopplerowską wzrost przepływu naczyniowego w trakcie obniżania temperatury, jak i w większym nasileniu w okresie po rozmrożeniu. Wykluczono, by ten objaw, klinicznie manifestujący się rumieniem okalającej skóry, wynikał z czynników emocjonalnych.

W ciągu 2-3 godz. po zamrożeniu dopływ krwi ponownie zmniejsza się i zjawisko to nasila się w ciągu 12 godz. Obszar zmian naczyniowych jest jednak mniejszy niż pierwotnie, a sąsiedztwo większych naczyń jeszcze bardziej go ogranicza.

W obrazie mikroskopowym obrzęk, ogniskowe uszkodzenie naczyń włosowatych, mikrozatory i mikrowylewy krwi wskutek wzrostu przepuszczalności naczyń można dostrzec już po 2 godz. Odcinkową martwicę ścian naczyń stwierdzano po 5-8 godz.

Podobne zmiany obserwowano, wykorzystując metodę elektronowej mikroskopii transmisyjnej (transmission electron microscopy – TEM), w której stwierdzono skoagulowane erytrocyty przyklejone do ścian naczyń oraz kondensację jąderek komórek endotelium po 2 godz. od krioablacji ciekłym azotem skóry myszy i ich zanik po 24 godz. od zamrożenia, co oznaczało ich martwicę.

Zakrzepica końcowych tętnic prowadząca do martwicy pojawia się po głębokim zamrożeniu i była stwierdzana arteriograficznie między 1. a 7. dniem. Mechanizm jej powstania nie jest do końca poznany, przypuszcza się udział dodatkowych urazów lub infekcji. Odwracalny charakter części uszkodzeń naczyniowych sugeruje, że opóźniona zakrzepica mogłaby dominować w oddzielaniu się tkanki martwiczej.

Badania wskazują na różną podatność na zamrożenie elementów naskórka i skóry. Martwicę keratynocytów powoduje temperatura rzędu -20°C – -30°C. Przy czym bardziej wrażliwe są keratynocyty podstawne niż kolczyste. Już niewielkie zamrożenie powoduje odwarstwienie naskórka od skóry właściwej i powstanie podnaskórkowego pęcherza. Brak przeżycia komórek skóry obserwowano po pojedynczym cyklu mrożenia i obniżeniu temperatury tkanki do -50°C. In vitro martwicę komórek skóry i napletka stwierdzano w temperaturze -40°C – -50°C i była ona niższa niż konieczna dla zniszczenia komórek raka krtani.

Najbardziej znamienna jest mała wrażliwość komórek tkanki łącznej, które przeżywają po oziębieniu do -30°C – -35°C. Siatka włókien kolagenowych skóry świni pozostawała nieuszkodzona po zamrożeniu natryskiem w czasie 30 s, a więc w przeciętnym dla większości działań kriochirurgicznych. Włókna tworzą zrąb, wokół którego następuje odnowa komórek, co wpływa na późniejszy kosmetyczny wygląd blizny po zabiegu. Jednak dłużej trwające zamrożenie może powodować pojawienie się wyniosłej blizny. Biopsje po 6 miesiącach wskazywały też na wyraźne pogrubienie naskórka.

Zniszczenie i brak odnowy elastyny obserwowane po jedno- i dwukrotnym zamrożeniu skóry małpy do temperatury -40°C – -60°C w czasie 4 min nie powodowały widocznego obkurczania się rany. Odwrotnie jak po oparzeniu, zamrożenie skóry szczura, przy podobnym nasileniu uszkodzenia, nie prowadziło do obkurczenia związanego z reparacją, co zdaniem Li i wsp. wynikało z zachowania macierzy kolagenu i funkcji miofi broblastów.

Następstwem zabiegów kriochirurgicznych są zmiany zwyrodnieniowe włókien osiowych i komórek Schwanna, a zaburzenia czucia po 10-sekundowym natrysku występują nawet do 10 miesięcy. Prawidłowe czucie przywraca odnowa aksonu wzdłuż onerwia, które – zbudowane z włókien kolagenowych – pozostaje w dużym stopniu odporne na zamrożenie. Regeneracja jest wcześniejsza u młodszych pacjentów, zaś czucie dotyku powraca szybciej niż bólu i zimna. U 1/5 leczonych z przewlekłymi zespołami bólowymi blokada nerwów po ich dwukrotnym 2-minutowym zamrożeniu w temperaturze -60°C powodowała całkowite ustąpienie bólu przez średnio 11 dni.

Blizna po kriochirurgii, charakteryzująca się pogrubieniem naskórka i ścieńczeniem skóry, klinicznie przejawia się najczęściej jedynie odbarwieniem. Jak wykazali Gage i wsp., melanocyty skóry psa ulegały wybiórczemu zniszczeniu w przedziale temperatur -4°C – -7°C, podczas gdy keratynocyty pozostawały niezmienione w temperaturze -20°C. Repigmentacja była zależna od temperatury i nie stwierdzano jej w czasie 4 miesięcy obserwacji po zamrożeniu poniżej -30°C. Badania metodą strippingu skóry świnek morskich, mrożonych natryskiem przez 25 s, wskazują, że przebarwienie wokół ognisk odbarwień zależało od migracji melanocytów do warstwy podstawnej naskórka i być może również od wzmożonej syntezy melaniny w obrębie komórek, które przeżyły zamrożenie na obwodzie pola. Brak barwnika w centrum ognisk, nawet po głębokim zamrażaniu, był zjawiskiem przejściowym i barwa skóry powracała wskutek masywnego napływu komórek z obrzeża.

Badanie odbarwień przy użyciu mikroskopu elektronowego wykazywało morfologicznie prawidłowe melanocyty, a keratynocyty zawierały dojrzałe melanosomy. Zamrażanie przedłużone do 30 s i powtórzone dwukrotnie prowadziło do wyraźnego zmniejszenia liczby melanocytów i całkowitego zaniku melanosomów w keratynocytach. Natomiast, podobnie jak u zwierząt doświadczalnych, obwodowe przebarwienie wynikało z obecności melaniny w naskórku.

Długotrwałe utrzymywanie się odbarwień po zamrożeniu lub ich bardzo powolne cofanie się jest, być może, związane z uszkodzeniem skórnych zakończeń nerwowych. Hipoteza o wpływie czynników neurogennych na syntezę melaniny lub migrację melanocytów, mimo notowanych obserwacji klinicznych, pozostaje w sferze spekulacji.

Wrażliwość melanocytów na niskie temperatury nie dotyczy jednak głębiej osadzonychw skórze znamion melanocytarnych śródskórnych, które charakteryzują się opornością na leczenie kriochirurgiczne.

Mieszki włosowe, mimo głębokiego osadzenia w skórze, są bardzo podatne na obniżenie temperatury. Po 10 s natrysku skóry świnek morskich, których budowa mieszka jest podobna do ludzkiego, w biopsjach kontrolnych stwierdzano jedynie homogenne pozostałości tych przydatków. Mechanizm uszkodzenia jest prawdopodobnie złożony i zależny zarówno od bezpośredniego działania zamrożenia, jak miejscowej aktywności proteolitycznej wyzwolonej rozpadem komórek. Bardzo skąpy naciek komórek zapalnych w otoczeniu raczej wyklucza ich udział w tym procesie. Zawartość zniszczonych mieszków była wydzielana na powierzchnię skóry bądź – częściej – rozkładana in situ. Wrażliwość mieszków na zamrożenie wykorzystano w leczeniu kriochirurgicznym podwinięcia rzęs, u innych chorych może ograniczać zakres metody.

Od lat 70. podejmuje się próby wyjaśnienia wpływu układu immunologicznego na wynik zabiegu kriochirurgicznego, zwłaszcza zmian nowotworowych. Zniszczenie tkanki zamrożeniem powoduje uwolnienie elementów antygenowych, co u zwierząt doświadczalnych przejawia się obecnością przeciwciał lub zmian morfologicznych w obwodowych narządach limfatycznych, świadczących o rozwoju immunizacji. W części doświadczeń wywołano także objawy morfologiczne lub kliniczne, typowe dla odpowiednich zespołów rozwijających się na tle autoimmunologicznym (nerki, jądra). Wszystkie stwierdzane zmiany występowały jednak przejściowo i posiadały charakter nieswoisty.

Limfocyty i surowica zwierząt z mięsakami wywołanymi metylocholantrenem po jednokrotnym leczeniu kriochirurgicznym wykazywały większy poziom cytotoksyczności w porównaniu z analogicznymi nowotworami leczonymi chirurgicznie. Ta i podobne obserwacje dotyczące kriochirurgii nowotworów u zwierząt doświadczalnych zbiegły się z doniesieniami o przypadkach nie tylko całkowitej inwolucji guza pierwotnego niszczonego miejscowo zamrożeniem, nie zawsze w sposób doszczętny, ale także i jego przerzutów narządowych, m.in. u chorych z rakiem gruczołu krokowego.

Pojawienie się limfocytów cytotoksycznych Tc skierowanych przeciw komórkom guza wykazano w wielu nowotworach. W warunkach in vivo limfocyty nie wykazują jednak takiej aktywności jak podczas ekspozycji na komórki guza in vitro. Być może jest to spowodowane pojawieniem się specyfi cznych komórek supresorowych bądź obecnością produkowanych przez guz cytokin hamujących dojrzewanie komórek efektorowych. Można hipotetycznie przyjąć, że zamrażanie in situ indukuje dojrzewanie tych uczulonych, ale do tej pory nieaktywnych limfocytów, reagujących z komórkami guza. Johnson tłumaczy to dwoma mechanizmami.

Pierwszy z nich związany jest z uwolnieniem wielu cytokin w trakcie procesu zapalnego, jaki towarzyszy destrukcji tkanek po ich zamrożeniu. Może to stwarzać sprzyjające środowisko dla rozwoju dojrzałych komórek efektorowych, a także powodować wzrost ekspresji cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej (major histocompatibility complex – MHC) na komórkach nowotworowych (w wielu przypadkach wykazano ich brak lub zmniejszenie) i cząstek adhezyjnych (intercellularadhesion molecule – ICAM). Drugi mechanizm, według Johnsona, wiąże się ze zwiększeniem ekspresji antygenów MHC klasy II, a przez to ułatwieniem funkcji komórek pomocniczych CD4+ i komórek prezentujących antygen. Zjawisko to mogłoby prowadzić do pobudzenia i dojrzewania limfocytów cytotoksycznych, niszczących również odległe przerzuty guza. Podobne hipotezy wysuwa Kasuya i wsp., którzy na eksperymentalnym modelu myszy stwierdzili wzrost migracji komórek dendrytycznych do regionalnych węzłów chłonnych i ich napływ do nacieku zapalnego otaczają cego miejsce po krioablacji, co może przyczyniać się również do swoistej odpowiedzi immunologicznej w kierunku antygenów wirusowych lub nowotworowych, odsłoniętych w wyniku pokriodestrukcyjnej martwicy komórek.

Dalsze badania nad swoistą aktywnością komórek cytotoksycznych izolowanych od chorych przed zabiegiem kriochirurgicznym i po nim być może pozwolą zrozumieć, na ile w rzeczywistości skutki  zamrażania są modulowane mechanizmami immunologicznymi.

Stwierdzono, że powierzchowne zamrożenie, powodujące jedynie nieznaczny rumień u niektórych zwierząt doświadczalnych, prowadzi do uszkodzenia nie tylko morfologicznego, ale również czynnościowego komórek Langerhansa. Objawiało się to m.in. przejściowym zniesieniem zdolności skóry do wywołania reakcji nadwrażliwości na DNCB i wykazywało podobieństwo do skutków działania UVB i PUVA.