Dermatologia Praktyczna

MIKROSKOPIA KONFOKALNA

Mikroskopia konfokalna jest techniką obrazowania umożliwiającą osiągnięcie wysokiej rozdzielczości i kontrastu rejestrowanego obrazu mikroskopowego w różnych płaszczyznach przekroju preparatu. W zależności od konfiguracji mikroskopy konfokalne mogą być transmisyjne lub odbiciowe. W porównaniu z konwencjonalną mikroskopią badanie za pomocą mikroskopii konfokalnej umożliwia osiągnięcie lepszego kontrastu i rozdzielczości. Dostarcza obrazów bardzo wysokiej jakości z drobnymi szczegółami. Dodatkowo ta technika obrazowania pozwala na rekonstrukcję wirtualnych trójwymiarowych obrazów.

Zarówno mikroskopia konwencjonalna, jak i konfokalna może używać światła odbitego lub fluorescencyjnego do wizualizacji próbki. Jednak w mikroskopii konfokalnej wiązka nadchodzącego światła (wiązka wzbudzania) koncentruje się poprzez obiektyw mikroskopu na małym miejscu wewnątrz tkanki.

Mikroskopia konfokalna charakteryzuje się obecnością przysłony konfokalnej (pinhole) i punktowego skanowania próbki. Problemem tej techniki może być tzw. fotowybielenie/fotoblaknięcie (photobleaching), spowodowane tym, iż rejestracja obrazów w odpowiednich płaszczyznach jest dość czasochłonna i wymaga dłuższej ekspozycji.

Stosowane obecnie mikroskopy konfokalne to mikroskopy skanujące lub mikroskopy z wirującym dyskiem:

• skanujące laserowe mikroskopy konfokalne (laser scanning confocal microscopes – LSCM), dające obrazy najlepszej jakości, ale charakteryzujące się długim czasem obrazowania,
• mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem (spinning-disk confocal microscopes), pozwalające na bardzo szybkie zbieranie obrazów, co daje możliwość montowania sekwencji filmowych.

Najczęściej stosowaną w badaniach dermatologicznych dla badań in vitro lub ex vivo wydaje się fluorescencyjna mikroskopia konfokalna. Światło wzbudzania we fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej jest zwykle dostarczane przez laser przy długości fali, która również wzbudza specyficzny fluorochrom. W niektórych przypadkach może być użyty w tym samym czasie więcej niż jeden fluorochrom, wówczas poprzez manipulację światłem wzbudzania lub przez obserwacje przy różnych długościach fali emisji poszczególne części próbki mogą być rozróżniane. Zarówno światło lasera (wiązka wzbudzająca), jak i wypadkowa emisji fluorescencji przechodzi przez dzielnik wiązek, zazwyczaj jest to zwierciadło dichroiczne, które odbija światło lasera, a przepuszcza światło fluorescencji z badanego materiału (oddzielenie wiązek światła). Następnie światło fluorescencji przechodzi przez przysłonę konfokalną, która pełni funkcję filtra przestrzennego i przepuszcza jedynie światło pochodzące z płaszczyzny ostrości obiektywu (eliminacja światła o gorszych parametrach optycznych). Poprzez zmianę płaszczyzny ostrości preparatu następuje tworzenie jego przekrojów optycznych.

Badania in vivo obrazujące ultrastrukturę ludzkiej skóry przy pomocy mikroskopii konfokalnej rozpoczęły się we wczesnych latach 90. XX wieku. Konfokalne obrazowanie prawidłowej skóry in vivo ukazuje dobrą korelację z konwencjonalną histologią. Obrazując skórę w czasie rzeczywistym, najpierw są wizualizowane najbardziej powierzchowne warstwy naskórka i warstwa rogowa. Warstwa rogowa pojawia się jako jaskrawy, intensywnie świecący obraz spowodowany powrotem rozproszonego światła na granicy medium immersyjne-tkanka. Następnie pojawia się warstwa ziarnista składająca się z komórek z jasną ziarnistą cytoplazmą otaczającą duże, ciemne i owalne jądro. Warstwa kolczysta naskórka przedstawia się jako wzór plastra miodu z mniejszymi komórkami. Najgłębsza warstwa naskórka, warstwa podstawna, jest widoczna jako jasne skupiska komórek wzdłuż połączenia skórno-naskórkowego.

Refleksyjna mikroskopia konfokalna – zastosowanie, ograniczenia i perspektywy

Większość obecnych systemów do mikroskopii konfokalnej używa strategii skanowania laserem i może być stosowana w dermatologii: np. refleksyjna mikroskopia konfokalna in vivo (in vivo reflectance confocal microscopy – RCM) może być stosowana do opisu zmian pigmentacyjnych w skórze spowodowanych procesem starzenia się lub specyficznymi bodźcami, jak promieniowanie ultrafioletowe (UVR). W przeprowadzonym doświadczeniu badacze byli w stanie wykryć UVR-indukowane zmiany pigmentacyjne w skórze pigmentowanych świnek morskich, popularnego modelu zwierzęcego dla badań ludzkiej biologii pigmentacyjnej. Udowodniono, że zmiany mogą być wykryte, zanim reakcja organizmu na opalanie będzie widoczna klinicznie, obejmując zwiększenie rozmiaru melanocytów, a także liczbę i pigmentację keratynocytów w napromieniowanym naskórku. Istnieje także możliwość RCM w czasie rzeczywistym („na żywo”) generująca optyczne skrawki w obrębie nienaruszonej tkanki. Ze względu na rozdzielczość komórkową (cellular resolution) może być przydatnym narzędziem do badań powierzchni skóry, naskórka i powierzchownych warstw skóry właściwej.

RCM to nowoczesna, nieinwazyjna metoda diagnostyczna, pozwalająca na wizualizację tkanek z dokładnością porównywalną do osiąganej metodami histologicznymi, znajdująca coraz szersze zastosowanie w diagnostyce nowotworów skóry. Warto zauważyć, że melanina działa jako naturalny czynnik kontrastowy dla RCM, a sama technika może służyć do poprawy skuteczności diagnostycznej w rozpoznaniu czerniaka przez identyfikację zarówno cech nowotworowych w zmianach wyglądających łagodnie, jak i łagodnych zmian o klinicznych cechach nowotworu. RCM wydaje się również pomocna w diagnostyce niemelanocytowych nowotworów skóry. Ocena wygenerowanych wysokorozdzielczych obrazów mikroskopowych ma szczególne znaczenie przy niejednoznacznych, niewielkich zmianach skórnych, trudnych do interpretacji lub też w przypadku pacjentów podlegających leczeniu immunosupresyjnemu. Co ciekawe, na podstawie RCM stworzono kryteria rozpoznania raka podstawnokomórkowego i czerniaka in situ. Obecne ograniczenia RCM to limitowane pole widzenia i wysoki koszt w porównaniu z rutynową mikroskopią czy dermatoskopią.

Mimo niewątpliwych zalet mikroskopii konfokalnej, należy jednak mieć świadomość potrzeby dopracowania istniejących systemów w kontekście konieczności precyzyjnego obrazowania skóry jako złożonej struktury wielopłaszczyznowej. W świetle powyższego, odbiciowa mikroskopia konfokalna, stosowana pioniersko w badaniach dermatologicznych in vivo, okazała się zupełnie nieskuteczna w przypadku diagnostyki zmian położonych w głębszych partiach skóry, takich jak np. rak kolczystokomórkowy. Ponadto należy pamiętać, że w schorzeniach autoimmunizacyjnych, do których należą choroby kręgu pęcherzycy, kluczowe znaczenie diagnostyczne ma wykrycie zjawisk autoimmunizacyjnych (przykładowo zaawansowanymi technikami typu super resolution microscopy), a inne techniki, które tego nie umożliwiają, dostarczają jedynie informacji o procesach patogenetycznych w analizowanych obszarach.

Obecne ograniczenia RCM obejmują głębokość obrazowania, która jest zawężona do warstw powierzchownych skóry właściwej z powodu tkankowo-indukowanego rozproszenia i możliwych aberracji. Ponadto wykorzystywana aparatura jest relatywnie droga, złożona, duża i ciężka do stosowania w trudno dostępnych miejscach anatomicznych. W związku z tym w opracowaniu są nowatorskie systemy umożliwiające wyeliminowanie wymienionych problemów (głębsze obrazowanie skóry, podręczne mikroskopy konfokalne). Ostatnio opracowano nowy mikroskop konfokalny skanujący liniowo (confocal line-scanning microscopes), obrazujący morfologię jądra i komórki w ludzkim naskórku. Obecnie są one laboratoryjnymi prototypami, jednak są dużo prostsze od stosowanej technologii skanowania punktowego i mogą perspektywicznie stanowić nową klasę podręcznych niskokosztowych mikroskopów konfokalnych dla obrazowania skóry.

Mikroskopia wielofotonowa

Jak wspomniano wcześniej, jednym z ograniczeń standardowej mikroskopii konfokalnej jest niewielka głębokość penetracji próbki. Może być ono jednak zniesione dzięki coraz bardziej popularnej mikroskopii wielofotonowej. W mikroskopii konfokalnej wielofotonowej wzbudzenie substancji światłoczułej dokonuje się na przykład za pomocą dwóch niskoenergetycznychfotonów. Przewaga tej techniki nad konwencjonalną mikroskopią konfokalną to ochrona fluorochromów przed wyświecaniem i możliwość badania grubszych preparatów (skrawków tkankowych). W technice tej wzbudzenie fluorochromów jest ograniczone do jednej płaszczyzny preparatu o maksymalnej ostrości i stąd następuje emisja fluorescencji (zniesienie potrzeby przysłony konfokalnej, zmniejszenie ilości wzbudzeń fluorochromów, a w konsekwencji zapobieżenie szybkiemu wyświecaniu). Przyjmuje się, że mikroskopiadwufotonowa może tworzyć obrazy przekrojów optycznych nawet ponad 5 razy głębiej niż standardowe mikroskopy konfokalne. Kolejną zaletą takiego systemu jest możliwość użycia fotonów o mniejszej energii, a zatem stosowania światła podczerwonego o mniejszym współczynniku rozproszenia w tkance. Wadą tej metody jest natomiast konieczność stosowania drogich i skomplikowanych laserów. Mikroskopia wielofotonowa wciąż jest na wczesnym etapie rozwoju, jeśli chodzi o obrazowanie skóry in vivo, jednak wydaje się być obiecująca. Kolagen, elastyna, cytoplazma komórkowa i jądro są łatwo i specyfi cznie widoczne w mikroskopii wielofotonowej skóry in vivo, dając szanse zastosowania tej techniki w nanodermatologii.

Omawiając możliwości i użyteczność mikroskopii konfokalnej, należy pamiętać, że mimo niewątpliwych zalet nie jest to technika, która wyparła zastosowanie standardowej mikroskopii fluorescencyjnej w codziennej diagnostyce dermatologicznej. Wadami zastosowania mikroskopii konfokalnej w porównaniu z konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym są: 1) dłuższy czas zbierania obrazu (brak możliwości natychmiastowego podglądu całego badanego skrawka), 2) koszty zakupu i utrzymania specjalistycznego systemu mogą być nawet o rząd wielkości wyższe niż wydatki przeznaczone na standardową mikroskopię fluorescencyjną. W piśmiennictwie można się natknąć również na rozbieżności wyników biochemiczno-molekularnych i LSCM, co sugerowałoby ostrożną interpretację wyników obrazowych oraz potwierdzanie ich innymi technikami. Powstaje zatem pytanie o celowość stosowania tych metod w praktyce dermatologicznej: zapewne są niezbędne do celów badawczych i identyfi kacji nowych potencjalnych mechanizmów/cząsteczek patogenetycznych, jednak wydają się technikami zbytecznymi w rutynowej diagnostyce. Większość produkowanych mikroskopów konfokalnych podlega ograniczeniu rozdzielczości przestrzennej (co nie pozwala na analizę struktur mniejszych niż ok. 250 nm). Jest to spora wada utrudniająca lub wręcz uniemożliwiająca prowadzenie niektórych prac badawczych w biomedycynie, w tym w dermatologii. Rozwiązaniem tego problemu może być stosowanie modułu STED (stimulated emission depletion), który umożliwia obrazowanie z rozdzielczością poniżej limitu dyfrakcji.

MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA

W mikroskopie elektronowym zamiast światła wykorzystuje się wiązki elektronów, przyspieszanych pod wpływem silnego pola elektrycznego. Mikroskopy elektronowe możemy podzielić na: 1) skaningowe mikroskopy elektronowe (scanning electron microscopy – SEM), 2) transmisyjne mikroskopy elektronowe, 3) emisyjne mikroskopy elektronowe, 4) odbiciowe mikroskopy elektronowe.

SEM można stosować do wysokiej rozdzielczości analizy trójwymiarowej skóry i jej przydatków. Dotychczasowe dane ujawniają użyteczność tej metody w badaniu włosów. Jednak istnieje kilka doniesień o przydatności SEM w autoimmunizacyjnych dermatozach pęcherzowych.

Badacze wykorzystali tę technikę do porównania ultrastrukturalnych aspektów pokrywy pęcherza w trzech chorobach o różnym mechanizmie patogenetycznym prowadzącym do odmiennego obrazu rozpadu/rozwarstwienia tkanki: śródnaskórkowej akantolizy (choroby kręgu pęcherzycy), dysfunkcji półdesmosomów (pemfi goid pęcherzowy) i uszkodzenia kolagenu typu VII prowadzącego do utraty naskórka oraz błony podstawnej (postać dystrofi czna pęcherzowego oddzielania się naskórka – DEB).

W pęcherzycy metoda ta była w stanie udokumentować zjawisko akantolizy spowodowane uszkodzeniem desmosomów, widoczna była utrata przylegania międzykomórkowego keratynocytów, które stały się wieloboczne/wielokątne. Wyniki te okazały się gorsze dla pemfigoidu pęcherzowego (bullous pemphigoid –BP) i ukazywały jedynie wygląd błony komórkowej keratynocytów podstawnych. W DEB, na skutek patologicznej utraty błony podstawnej, metoda ta była w stanie ujawnić ultrastrukturę kolagenu typu VII. Możliwa była również obserwacja adhezji włókien kolagenowych do błony komórkowej i ukazanie czynności półdesmosomów w 3D. Chociaż SEM jest trudna do stosowania w diagnostyce autoimmunizacyjnych dermatoz pęcherzowych, udowodniono jej przydatność w uwidocznieniu wzoru uszkodzenia tkanki w tych chorobach.

Potrzeba całkowitego odwodnienia próbki ogranicza użycie konwencjonalnej mikroskopii elektronowejw biologicznych próbkach, w których woda jest głównym składnikiem. Odwodnienie tkanki skutkuje utratą agregacji, a stosowane do wzmocnienia kontrastu obrazu barwienie metalami ciężkimi sprawia, że widoczne są depozyty czynnika kontrastowego. Wymienione problemy może rozwiązać specjalny system kriomikroskopii elektronowej (cryo-electron microscopy of vitreous sections – CEMOVIS). W tej metodzie próbki biologiczne grubości do ok. 200 mikrometrów są utrwalane przez ultraszybkie chłodzenie pod silnym ciśnieniem. Następnymi etapami są: cięcie na bardzo cienkie skrawki i obserwacja w krioelektronowym mikroskopie. W ten sposób nanostruktura skóry może być badana w jej natywnym i w pełni uwodnionym stanie, bez chemicznego utrwalenia czy barwienia. CEMOVIS pomaga w niektórych kwestiach biologii dermatologicznej, jak badanie struktury i funkcji filamentów pośrednich keratyny czy organizacji kadheryn desmosomalnych.

MIKROSKOPIA SOND SKANUJĄCYCH ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM MIKROSKOPII SIŁ ATOMOWYCH

Mikroskopia sond skanujących cechuje się bardzo wysoką rozdzielczością, bliską rozdzielczości atomowej. Do mikroskopów z sondą skanującą zaliczyć należy: skaningowy mikroskop tunelowy (scanning tunneling microscopy – STM) oraz mikroskop sił atomowych (atomic force microscopy – AFM). W przeciwieństwie do mikroskopii elektronowej, w analizie AFM badana próbka nie wymaga kontrastowania, specyficznych modyfikacji lub zamrażania. AFM pozwala na uzyskaniu in vitro lub ex vivo obrazów morfologii skóry w nanoskali i w wysokiej rozdzielczości.

Połączenia desmosomalne są wyspecjalizowanymi strukturami istotnymi dla adhezji komórkowej w obrębie naskórka. Zniszczenie tych połączeń i rozwój autoprzeciwciał skierowanych przeciwko białkom desmosomalnym jest charakterystyczne dla pęcherzycy. Jednak wiele szczegółów dotyczących czynności połączeń desmosomalnych w normalnych i patologicznych warunkach wymaga oceny. Istniejące techniki nie są wystarczająco dostosowane do oceny w wysokiej rozdzielczości zależności budowa–czynność dla złożonych struktur, jakimi są połączenia desmosomalne. W tym kontekście AFM jest stosowana do szczegółowego uwidocznienia i charakteryzacji połączeń komórkowych ludzkich komórek nabłonka/naskórka. Przy pomocy tej techniki wykazano, że anty-DSG3 przeciwciała są związane ze zmianami na powierzchni komórki ludzkich keratynocytów i zmianami w obrębie keratynocytowych międzykomórkowych struktur adhezyjnych, wspierając twierdzenie, że powierzchnia komórkowa i połączenia są modyfikowane przez wiązanie specyficznych autoprzeciwciał. Dodatkowo molekularna struktura połączeń szczelinowych (gap junctions) może być bardziej dokładnie analizowana i charakteryzowana przez AFM, oferując nowe technologiczne podejście, umożliwiające lepsze zrozumienie mechanizmów choroby i potencjalne monitorowanie strategii terapeutycznych w chorobach kręgu pęcherzycy.

AFM okazała się również przydatna do analizy morfologicznych właściwości próbek włosów pobranych od pacjentów z łuszczycą. Jak wiadomo, łuszczyca nie dotyczy jedynie keratyn miękkich skóry, ale też keratyn twardych paznokci i włosów. Jednakże, jak dotąd, niewiele badań oceniało zmiany włosów u pacjentów łuszczycowych. Analiza AFM pokazuje, że trzon/łodyga włosa pacjentów z łuszczycowym zajęciem owłosionej skóry głowy wykazuje te same makrozagłębienia jak obserwowane w paznokciach. Badania z zastosowaniem AFM mogą stanowić zatem wsparcie tezy o uogólnionej naturze łuszczycy, gdzie zmiany w strukturze włosów stają się analogiczne do zmian obserwowanych w skórze i paznokciach.